Флуориметрический анализ воды: принцип работы, определение величин, чувствительность

Для анализа содержания химических веществ в растворах можно использовать такое свойство веществ, как флуоресценцию. Облучение некоторых веществ излучением с фиксированной длиной волны приводит к тому, что они начинают светиться. Измерение интенсивности и других параметров такого свечения позволяет судить о концентрации и составе веществ в исследуемой пробе.

Общие сведения о флуориметрии

Кто открыл люминесцентный метод?

Первые упоминания специфичного свечения некоторых растворов датируются работами испанского ботаника Н. Монардеса от 1577 года. Дальнейшее изучение этого явления и первые предположения о возможности его использования произошли на три века позже. Флуоресценцию соединений хинина наблюдал в 1852 физик Джордж Стокс, также известный по своему вкладу в такие области физики, как гидродинамика и оптика. Ему также принадлежит предположение о возможности использования этого метода для химического анализа. Первым практическим применением флуоресцентного метода анализа стало опубликованное в 1867 году Гоппельшредером исследование ионов Al^III+.

Интересно, что наблюдать явление флуоресценции хинина можно и в быту – достаточно осветить бутылку тоника Schweppes ультрафиолетовым светом и содержащейся в нём хинин начнёт светиться.

Принципы работы и сущность

Принцип явления флуоресценции заключается в способности электронов переходить между энергетическими уровнями под воздействием возбуждающего излучения. Поскольку положение электрона на определенном энергетическом уровне в атоме – равновесное состояние, перевод или возбуждение электрона приводит к нестабильности системы. Эта нестабильность проходит со временем – возбужденный электрон возвращается в свое нормальное состояние.

Разница энергии между возбуждённым и основным состояниями электрона не может исчезать бесследно в связи с законом сохранения энергии, поэтому она расходуется на процесс релаксации. Та часть энергии, которая не была на него затрачена, испускается в виде фотона с соответствующей энергией. Испускание такого фотона – основной механизм флуоресценции. Излучение фотона происходит в течение сотых и тысячных долей секунды.

Флуоресценция – не единственный вид люминисценции. Фосфоресценция предполагает гораздо более длительные периоды свечения, что связано с механизмом возбуждения электронов вещества и некоторыми квантовыми явлениями. Это сильно отличает феномены фосфоресценции и флуоресценции друг от друга. Аналитическая значимость фосфоресценции достаточно низка, но вещества, обладающие такими свойствами, часто используют в различных изделиях: стрелки и циферблаты часов, приборов, стрелки аварийного выхода, игрушки.

Количественная и качественная флуориметрия

Флуоресцентный анализ достаточно точен, но есть нюансы. Метод подвержен влиянию внешних условий: рН среды, температуры, вязкости и других параметров среды. Из-за этого, количественная разновидность этого метода непроста в применении. Его точность бывает недостаточной при исследовании проб сложного состава, подверженных деструкции, чересчур вязких проб и других. В дополнение к этому, обратим внимание на мешающие количественной флуориметрии явления: экранировка молекул исследуемого вещества другими соединениями, паразитный свет, реабсорбция света исследуемыми молекулами, неравномерность распределения молекул по объёму пробы. Тем не менее, этот метод анализа незаменим при работе с биологическими соединениями, такими как белки и аминокислоты. Современное оборудование, используемое для флуориметрии, позволяет нивелировать большинство недостатков этого подхода.

Способность исследуемых веществ к люминисценции также может меняться при смене дисперсности, что позволяет проводить довольно точный анализ, если известны исходные спектры. Качественная флуориметрия использует информацию о спектрах испускания исследуемых веществ, но поскольку не все химические соединения способны испускать фотоны, именно этот метод используется в качестве вспомогательного при спектрофотометрии многокомпонентных систем. Ряд недостатков качественной флуориметрии не способен перевесить её достоинства, поэтому этот метод анализа предпочтителен в медицинских, биохимических и биологических исследованиях.

Величины измерения и погрешности

Главным достоинством флуориметрии следует считать её крайне высокую точность. Считается, что методы анализа, основанные на флуоресцентных свойствах веществ, точнее других спектрофотометрических методов в тысячу раз. Определённую погрешность в эти измерения вносят различные эффекты, упомянутые выше: экранирование, паразитный свет, реабсорбция и другие явления межмолекулярного и внутримолекулярного взаимодействия. Использование флуориметрии требует постройки калибровочного графика при помощи растворов исследуемого вещества нужной концентрации, а также умения подбора поправочных коэффициентов для учёта различных побочных явлений. Современные приборы чаще всего имеют ПО со встроенными опциями для автоматического использования различных уточняющих коэффициентов.

Обзор основных типов приборов

Фильтрационный флуориметр

Принципиальное устройство этого прибора включает в себя:

• Источник излучения. Чаще всего для флуориметров возбуждающим излучателем выступает лазер, реже – ксеноновая газоразрядная или ртутная лампа, либо светодиоды и светодиодные матрицы.
• Первичный фильтр длины волн. Этот компонент устраняет ультрафиолет, не позволяет превысить требуемую интенсивность возбуждающего излучения.
• Вторичный фильтр. Пропускает флуоресценцию в нужные исследователю области длины волн. Блокирует рассеянный пробой возбуждающий пучок.
• Детектор. Включает в себя фотоумножители для преображения светового сигнала в электрический.

Как правило, детектор излучения помещается под углом в 90 градусов к источнику возбуждающего излучения для устранения возможности попадания возбуждающего излучения на детектор. Спектральные фильтры применяются в качестве дополнительной меры предосторожности. Они позволяют вторичному возбуждающему излучению не воздействовать на детектор, не влиять на результаты анализа.

Спектрофлуориметр

Спектрофлуориметр отличается от фильтрующего в основном конструкцией светофильтров. Вместо спектральных фильтров в такие приборы устанавливаются различные монохроматоры: призмы или дифракционные решетки. Параметры дифракционной решётки (ширина щелей или величина ячеек решётки) оказывают непосредственное влияние на точность, чувствительность и разрешение анализа. Чаще всего решётки с меньшими ячейками показывают более высокую разрешающую способность и точность, но при этом заметно менее чувствительны к прохождению излучения через меньшие зазоры. В остальном конструкция спектрофлуориметра не отличается от фильтрующего флуориметра.

Флуориметрия и исследование воды

Какую воду можно исследовать?

Специфика метода диктует необходимость тщательной пробоподготовки для анализа. Любые твердые примеси из анализируемой воды должны быть удалены, поскольку они оказывают заметное влияние на флуоресцентные свойства вещества. Также, кислород выступает сильным гасителем флуоресценции, поэтому он должен быть максимально удалён из исследуемого раствора. Ещё один важный фактор, который необходимо учитывать до проведения флуориметрии – это то, что не все вещества способны к флуоресценции в воде. Поэтому следует знать свойства искомого вещества в пробе воды. Также, следует учитывать склонность некоторых флуоресцентных веществ к фоторазложению, то есть, следует хранить исследуемые образцы в темноте.

Что можно узнать, применяя флуориметрию?

Исследование проб воды при помощи флуориметрии позволяет с высокой точностью определять содержание и количество тех веществ, которые имеют свойство флуоресцировать в воде. Вместе с этим, высокая чувствительность метода ко внешним условиям и состоянию исследуемого вещества делает этот метод незаменимым для контроля изменений состояний веществ в биологических системах. Также, высокая чувствительность метода позволяет использовать флуориметрию в качестве дополнительного метода исследования для подтверждения или уточнения результатов спектрофотометрических исследований.

Как происходит определение показателей?

Общий принцип определения показателей пробы заключается в измерении отклика детектора при заданной длине волны и интенсивности возбуждающего излучения. В конечном результате, при исследовании методом флуориметрии измеряется величина интенсивности флуоресценции, связанная с концентрацией обнаруживаемого вещества. Эта зависимость носит экспоненциальный характер, что требует построения калибровочного графика. Этот график обычно строится с применением растворов искомого вещества с известными концентрациями и представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой описывается следующим образом:

tga = 2.3 × I0 × K × jкв. × e × l,

где I0 – интенсивность возбуждающего излучения,

K – коэффициент чувствительности прибора,

jкв. – квантовый выход люминисценции,

e – коэффициент молярной экстинкции исследуемого вещества при заданной возбуждающей длине волны.

Экономическая целесообразность метода

Флуориметры достаточно дороги в производстве и имеют высокую стоимость – порядка 35-40 тысяч долларов за базовые модели. Несмотря на определенные ограничения, накладываемые особенностями метода измерения, крайне высокая чувствительность приборов, а также и их способность измерять концентрации строго определённых веществ (т.е. высокая селективность) приводят к тому, что альтернатив им попросту нет.

Флуориметры служат важнейшими аналитическими инструментами на многих производствах – их экономическая целесообразность неоспорима. Флуориметры могут применяться для контроля сточных вод на производствах, обеспечивая высокую точность и селективность измерений при должной водоподготовке. Нет дополнительных расходов на плановые мероприятия – все действия обусловлены знанием.

Заключение

Флуориметрия – чувствительный и высокоселективный метод анализа. При этом он имеет ряд недостатков. Эти недостатки нивелируются современным оборудованием, но могут помешать проводить исследования с необходимой точностью.

Минусы метода:

• заметная зависимость от условий окружающей среды;
• строгие требования к исследуемой пробе;
• невозможность определения некоторых веществ, не способных к флуоресценции.

Плюсы:

• высокая точность;
• сравнительная простота пробоподготовки (при условии наличия подходящего оборудования);
• возможность контроля биохимических и биологических процессов.

Наибольшее применение флуориметрия находит в качестве: вспомогательного метода (для других спектрофотометрических видов анализа); метода контроля процессов, носящих биохимическую природу. Примерами лабораторий, в которых необходима установка флуориметров будут биохимические и фармакологические учреждения, то есть, те лаборатории, где точность анализа и чистота веществ будет иметь первостепенное значение.