Спектрофотометрическое исследование: количественный и качественный методы анализа, область применения, схема приборов

Спектрофотометрический метод анализа – один из наиболее распространенных методов как количественного, так и качественного анализа в современной химии. То же касается и сточных вод. Использование спектрофотометров позволяет количественно и качественно оценивать состав примесей, содержащихся в анализируемой пробе. Основа метода – способность химических соединений взаимодействовать с излучением, поглощая его. В процессе спектрофотометрического исследования находит применение излучение ультрафиолетовой (длина волны 200-400 нм), видимой (400-760 нм) и инфракрасной (760 и более нм) областей спектра. Спектрофотометры производят исследования как жидких, так и твёрдых образцов. Предлагаемый метод позволяет исследователю точно устанавливать элементный состав сплавов и металлических изделий из них.

При использовании спектрофотометра для контроля состава сточных вод возникает необходимость в создании лаборатории, поскольку некоторые анализы требуют предварительной подготовки проб. Примером может служить анализ сточных вод на содержание нефтепродуктов по ПНД Ф 14.1.272-2012, требующий предварительной экстракции и хроматографического отделения анализируемых веществ. Помимо того, способность таких приборов к точному определению даже следовых количеств веществ может позволять контроль с очень высокой степенью точности, необходимой для предприятий, работающих с тяжёлыми металлами, а также с другими высокотоксичными и опасными для окружающей среды химикатами.

Основания оптической спектрофотометрии

Спектрофотометрия основана на способности химических соединений и отдельных атомов взаимодействовать с электромагнитными волнами. Взаимодействие молекул исследуемых веществ с излучением в УФ, видимой и ИК-частях спектра приводит к построению прибором зависимостей, называемых спектрограммами (рис. 1, 2). Спектрограмма образца позволяет судить о его составе, причем, как в количественном, так и в качественном смысле.

Законы поглощения света

При прохождении пучка света или другого излучения через жидкость либо при падении этого пучка на твердую поверхность часть энергии пучка тратится на различные процессы: ионизацию, нагревание вещества, вторичное излучение (фотолюминисценцию) и ряд других. Различные вещества вызывают снижение энергии излучения по различным механизмам и их комбинациям. Описывает этот процесс закон Бугера-Ламберта, отвечающий за качественную сторону спектрофотометрического анализа и имеющий формулировку: «относительное количество поглощенного пропускающей средой света не зависит от интенсивности первоначального излучения. Каждый слой равной толщины поглощает долю проходящего монохроматического излучения».

Математически этот закон выражается так: I = I₀ * 10^—kl, где I₀ – интенсивность изначального падающего излучения, I – интенсивность прошедшего через вещество потока излучения, l – толщина поглощающего слоя вещества, k – коэффициент поглощения, соответствующий величине, обратной величине поглощающего слоя, необходимой для ослабления проходящего излучения в 10 раз.

Различные свойства материалов приводят к различной степени участия соседних атомов и молекул в описываемых процессах, поэтому для одноатомных газов и паров металлов характерно низкое значения коэффициента поглощения. Для металлов, напротив, значение коэффициента поглощения будет велико, поскольку падение излучения на металл приводит к его взаимодействию с электронами, свободно движущимися между узлами атомной решетки вещества. Закон Бэра формулируется так: «поглощение потока излучения прямо пропорционально числу частиц поглощающего вещества, через которое проходит данный поток излучения». Выраженный математически, он принимает вид: k = ε * c, где ε – коэффициент пропорциональности, также называемый коэффициентом молярного поглощения, с – концентрация вещества, k – коэффициент поглощения.

Законы Бугера-Ламберта и Бэра служат основой метода спектрофотометрического анализа. Считается, что если в исследуемой пробе содержится несколько веществ и эти вещества не взаимодействуют, то их оптические плотности складываются. Это утверждение называется законом аддитивности. Более подробно данные зависимости описаны в соответствующей литературе, поскольку существует большое количество нюансов и тонкостей работы со спектрофотометрическими методами анализа.

Видимый, инфракрасный и УФ спектры

Ультрафиолетовый, видимый и инфракрасный участки спектра – это тривиальные названия для излучений, длина волны которых лежит в пределах соответствующих им областей:

• 10-400 нм – ультрафиолет;
• 450-760 нм – видимый свет;
• 780-1500 нм – инфракрасное излучение.

Электромагнитное излучение с различной длиной волны сообщает облучаемому веществу различное количество энергии. Именно сообщение энергии образцам лежит в основе спектрофотометрических методов анализа. Способность различных длин волн света возбуждать различные атомы приводит к возможности осуществления качественного анализа проб.

Качественный и количественный анализ вещества

Поскольку пучок излучения, испускаемый прибором-спектрофотометром, взаимодействует как напрямую с атомами, так и со связями в молекулах веществ. Для каждого вещества существует характерный только для него спектр поглощения. По совокупности спектров поглощений в образце можно судить о присутствии тех или иных веществ в анализируемой пробе. Это называется качественным анализом, поскольку только указывает на наличие тех или иных соединений, но не на их количество.

Количественный же анализ использует установленный Бэром закон, который гласит о прямой зависимости между количеством частиц поглощающего вещества и поглощением потока излучения. По снижению интенсивности этого излучения можно судить о количестве частиц поглощающего вещества, а далее использовать это знание для расчёта количества вещества. Для подсчёта концентрации по количеству частиц часто используют число Авогадро.

Единицы измерения и формулы соединений

Спектрограммы, получаемые при различного рода спектроскопических исследованиях, достаточно информативны. Различные виды органических связей, присутствующих в веществах, приводят к возникновению так называемых «пиков». Величина этих пиков, выражаемая в интенсивности поглощения Т, а также их расположение на оси, соответствующей разным волновым числам в см^-1, позволяют точно судить о составе исследуемой пробы. Так, на рис.1 два ярко выраженных пика, находящихся в области 500-1000 см^-1, говорят о наличии в веществе связи С-Cl, а пики в области ~3000 см^-1 говорят о присутствии валентных колебаний связи С-Н. Для расшифровки спектров используются специальные таблицы характеристических частот поглощения. Опытные химики-аналитики, часто работающие со спектрограммами, способны быстро читать их, зачастую без использования таблиц.

Отличие метода спектрофотометрии от флуориметрии

Кажущаяся схожесть методов флуориметрического и спектрофотометрического анализа ошибочна. Различия этих методов лежат глубоко в физике исследуемых при анализе процессов. Также, явление флуоресценции, служащее основой соответствующего метода, может быть одним из процессов, происходящих в исследуемом спектрофотометрически веществе. Флуориметрический метод анализа базируется на способности некоторых веществ флуоресцировать при облучении монохроматическим светом – это яркая особенность взаимодействия отдельно взятого соединения с излучением. Спектрофотометрия же использует практически весь перечень доступных взаимодействий между веществом и излучением и, таким образом, является более широко применимым методом анализа.

ГОСТы для спектрофотометрии

Спектрофотометрия упоминается в большом количестве ГОСТов. Так, ГОСТ Р 58399-2019 устанавливает стандарт на неразрушающие методы контроля, к которым относится спектрофотометрия. ГОСТ 8.557-2007 устанавливает правила поверки для средств измерения спектральных, интегральных и редуцированных коэффициентов направленного пропускания и оптической плотности. ГОСТ Р 8.657-2009 устанавливает методику поверки инфракрасных спектрометров.

Устройства спектрофотометры

Принцип работы и схема прибора

Спектрофотометры имеют множество вариантов конструкции. В современном мире ИК-спектрометры зачастую используют технологию частичного пропускания ИК-излучения для получения информации о составе образцов. Принципиальная схема такого прибора приведена на рис. 4. Принцип работы такого прибора заключается в измерении степени поглощения ИК-излучения образцом, находящимся между источником излучения и детектором. Отдельно стоит отметить, что современные Фурье-спектрометры используют сложную оптическую систему (интерферометр Майкельсона), разделяющий потоки излучения и создающий интерференционную картину при помощи этого. Подвижное зеркало позволяет создать необходимую для исследования разность хода лучей, что приводит к получению сложной картины – интерферограммы, которая затем претерпевает Фурье-преобразование и становится ИК-спектрограммой.

 

Приборы, работающие в видимой и УФ-части спектра, обладают несколько иным принципом действия. Существует две основных схемы таких приборов, с разным расположением монохроматора. Эти схемы приведены на рис. 5 и рис. 6. Принцип их работы заключается в сравнении отраженного пучка излучения от исследуемого образца и от стандартного образца, оптическое поглощение которого принято считать равным нулю. По разности интенсивности пучка излучения можно судить об оптической плотности исследуемого вещества, а затем, в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера, становится возможным установление концентрации исследуемого вещества. За качественное определение в таком случае отвечает длина волны, при которой происходит поглощение света.

Оценка чувствительности аппаратов

Спектрофотометры обладают достаточно высокой чувствительностью. Из-за особенностей и требований метода анализа спектрофотометры зачастую настраиваются по-разному для различных испытаний, поэтому их чувствительность незначительно изменяется. Основными параметрами для этих оптических приборов служат ширина полосы пропускания, аппаратная функция установки и разрешающая способность установки. Аппаратная функция лишь показывает степень отклонений, вносимых в измерения самим прибором, когда как разрешающая способность и ширина полосы пропускания могут изменяться и зависят от параметров монохроматора, источника излучения и их сочетания.

Возможности и область применения спектрофотометров

Медицина и фармацевтика

Высокая чувствительность приборов к наличию посторонних веществ, а также способность устанавливать, что в исследуемой пробе происходят химические реакции обусловили применение спектрофотометров в медицинских и фармацевтических целях. Для многих лекарственных препаратов известны их спектры поглощения, поэтому процесс проверки чистоты образцов сводится лишь к сравнению получаемых в процессе исследования спектрограмм, что позволяет ускорить процесс контроля качества и сделать его более точным. Также, чувствительность прибора позволяет производить оценку многих проб на предмет происходящих изменений в них, что находит своё применение в ряде медицинских анализов.

Анализ пищи и питьевой воды

Также, как и с медициной, высокая чувствительность приборов позволяет устанавливать наличие малых количеств примесей в исследуемых образцах, что положительно влияет на качество и скорость анализа. Особенно ценным представляется способность спектрофотометров к обнаружению примесей тяжёлых металлов в анализируемых образцах.

Изучение неизвестных веществ

Изучение неизвестных веществ при помощи спектрофотометрии позволяет с высокой точностью определять состав исследуемой пробы. ИК-спектроскопия является важным и часто используемым аналитическим методом в процессе синтеза новых веществ и критически важна для качественного и количественного описания продуктов синтеза.

Металлургия и химпроизводство

Способность спектрофотометров работать с твёрдыми и жидкими пробами приводит к незаменимости этих приборов на металлургических и химических производствах. Спектрофотометрия – один из ведущих неразрушающих методов установления состава сплавов и их контроля. Он также широко применяется на нефтегазохимических производствах при оценке чистоты сточных вод.

Полиграфия, печать цветной графики

Поскольку спектрофотометры используют монохроматический свет, они находят применение в полиграфии и при работе с цветной графикой. Приборы способны с высокой точностью определять цвета и используются для проведения точечных и автоматических анализов, результаты которых нужны для создания максимально точных профилей работы печатного оборудования в соответствии со стандартами ICC – международного консорциума по цвету. ICC был создан в 1993 году такими лидерами индустрии, как: Apple, Agfa, Adobe, Kodak, Microsoft, Silicon Graphics, Sun Microsystems и Taligent.

Определение состава сточных и природных вод

Высочайшая чувствительность метода позволяет определять даже мизерные, следовые количества многих веществ. В работе, связанной с анализом сточных и природных вод, это свойство спектрофотометров делает приборы незаменимыми при обнаружении наиболее опасных примесей. Примером очень опасных примесей могут служить металлоорганические соединения ртути. Именно этот класс веществ ответственен за возникновение у человека такой болезни как синдром Минамата. В 1956 году в японской префектуре Кумамото было обнаружено высокое содержание метилртути – опасного даже в минимальных количествах нейротоксичного яда. Его нахождение в воде было обусловлено сбросом в океан неорганической ртути и её соединений, которая затем встраивалась в метаболизм микроорганизмов. В связи с кумулятивностью этого яда, его содержание росло вместе с ростом его носителя в пищевой цепочке. В устрицах залива Минамата содержалось до 85 мг/кг этого соединения, тогда как концентрация его в воде составляла всего лишь 0,6-0,7 мг/л.

Теоретически использование такого чувствительного и селективного метода, как спектрофотометрия, могло бы позволить обнаружить даже незначительные количества метилртути в образцах воды из залива. Таким образом, спектрофотометрия выступает важным методом анализа и оценки сточных вод.

Различие между сточными и природными водами

Сточные и природные воды отличаются между собой в первую очередь составом примесей. Природные воды содержат различные органические соединения природного происхождения, а также бактерии и другие микроорганизмы. Сточные воды могут содержать искусственные органические соединения, как, к примеру, побочные продукты различных синтезов, а также нефтехимические отходы, микропластик и ряд других загрязнений. В связи с этим, подход к анализу природных и сточных вод различен, и каждый случай имеет свою специфику. Использование спектрофотометров для контроля состава сточных вод производств удобно, поскольку технологический процесс диктует состав загрязнений. При знании состава загрязнений параметры прибора устанавливаются до начала его работы и могут быть неизменны, что облегчает и ускоряет работу. Природные же воды могут содержать большое количество различных примесей различного происхождения, что обуславливает необходимость дополнительной пробоподготовки перед проведением анализа.

 Этапы проведение спектрофотометрии стоков

Подготовка образцов исследуемой воды

Образцы исследуемой воды следует подготавливать в зависимости от используемого метода анализа (ИК-, УФ- или оптическая спектроскопия), а также выделять предполагаемые загрязнения при количественном анализе. Мутные воды зачастую не подходят для работы на спектрофотометрах с кюветами, предназначенных для жидких образцов, поэтому их отделяют от жидкой части пробы и анализируют отдельно с использованием соответствующих методов.

Подготовка кювет и пробирок

Специфика спектрофотометрического анализа диктует необходимость использования кювет из особых оптических материалов, свободно пропускающих излучение при нужных исследователю длинах волн. Так, обычное стекло из оксида кремния блокирует УФ-излучение (поэтому невозможно загореть через окно) и, таким образом, не подходит в качестве материала для изготовления посуды, используемой в УФ-спектрофотометрии.

Как и в случае с другими применениями посуды в аналитической химии, кюветы, пробирки и вся другая посуда должны быть тщательно вымыты и высушены, чтобы не влиять на результаты анализа. С кюветами для оптических приборов работают аккуратно, исключая их загрязнение отпечатками пальцев или сколы оптического материала, поскольку и это влияет на качество анализа.

Н4. Приготовление контрольного раствора

Контрольный раствор в терминах оптических методов анализа представляет собой раствор с известными оптическими характеристиками. Поскольку принцип работы спектрофотометра строится на исследовании пропускания и поглощения света исследуемыми веществами, количественно это можно описать только в относительных единицах. Для установления такого отношения приготавливается стандартный раствор заданной оптической плотности, который принимается на нулевую точку при проведении исследований. Состав такого раствора зависит от условий, в которых будет работать спектрометр. Большинство современных приборов имеет встроенные стандартные образцы, относительно которых производится сравнение.

Титрование объектов

Указание волны света на монохроматоре

Длина волны излучения определяется монохроматором прибора. В качестве монохроматоров современные спектрофотометры используют дифракционные решетки, а также призматические устройства. Часто используются приборы с двойным монохроматором: сочетанием двух монохроматоров, установленных последовательно. При помощи этой части устройства возможно установить ту длину волны, с которой необходимо провести исследование. Ранние монохроматоры, такие, как монохроматор Черни-Тёрнера, могли иметь ручную регулировку угла поворота зеркала – одной из частей устройства, отвечающей за отделение света с указанной длиной волны, – но большинство современных приборов используют электронное управление зеркалами либо наборы дифракционных решёток с необходимым периодом и другими характеристиками. Интересно, что CD-R диски тоже являются своего рода дифракционными решетками, поскольку на их поверхности расположены канавки для записи информации. Именно эти канавки обуславливают способность таких дисков радужно «переливаться» в глазах наблюдателя. Период «решетки» CD-R диска – около 1,6 мкм.

Калибровка прибора

Калибровка прибора позволяет повысить точность измерений, а также убедиться в отсутствии нарушений в работе установки. Для обеспечения калибровки используются различные техники, но основные – это специальные светофильтры с установленным поглощением либо растворы таких веществ, как сульфат меди или сульфат кобальт-аммония. Шкалу длины волн прибора проверяют при помощи стеклянных фильтров с содержанием смеси празеодима и неодима либо холмия. Все калибровочные мероприятия следует проводить с использованием ртутно-кварцевых или газоразрядных водородных ламп. Частота калибровки напрямую зависит от режима использования прибора. Решение о проведении калибровочных мероприятий принимается зачастую руководством лаборатории.

Большинство современных спектрофотометров обладают предустановленными сервисными программами и встроенными деталями, позволяющими проводить калибровку нажатием одной кнопки. В случае, когда есть подозрение, что калибровочные мероприятия неточны, могут использоваться услуги организаций, оказывающих техническую поддержку, включающую поверку и калибровку лабораторного оборудования.

Измерение оптической плотности образца

После полной подготовки к проведению анализа образец помещается в рабочую камеру прибора. Современные электронные спектрофотометры работают в полностью автоматизированном режиме и требуют минимального контроля. Более старые модели, однако, требуют ручной подстройки параметров прибора и расчета относительной оптической плотности образца по показаниям, считываемым в окуляре. После измерения оптической плотности при различных длинах волн строится график-спектрограмма.

В случае использования ИК-спектроскопов, процесс происходит несколько иначе. Используемые сейчас современные Фурье-спектрометры изначально строят интерферограмму, чтение которой невозможно без её предварительной математической обработки. После Фурье-преобразования интерферограммы исследователь получает готовые к интерпретации спектрограммы. ИК-анализ позволяет установить колебания отдельных связей в молекулах, поэтому он обладает исключительной точностью, а также позволяет установить количество примесей по активности пиков в областях, соответствующих тем или иным связям.

Тем не менее, сильно загрязненные образцы могут вызвать затруднения при чтении спектрограммы, поскольку наличие слабых, но заметных колебаний в нехарактерных для исследуемого вещества областях может запутать исследователя. В случае неизвестности состава примесей исследователю может быть представлена так называемая «шумная» спектрограмма с большим количеством противоречащих друг другу пиков и сигналами самых разных функциональных групп различных органических веществ.

Контроль присутствия различных примесей

График зависимости оптической плотности от длины волны излучения имеет характерную форму для каждого вещества. Этот график сравнивают по форме с эталонными графиками, представленными в литературе, и делают выводы о наличии или отсутствии примесей. Концентрацию веществ устанавливают по относительной оптической плотности, т.е. по «высоте» так называемых пиков.

ИК-спектроскопия позволяет с высокой точностью определять количество примесей, но только в случаях относительно малого количества отдельных загрязняющих веществ. Пробы сильно загрязнённой воды, содержащие до десяти различных органических веществ, поддаются анализу и интерпретации результатов достаточно легко, а образцы природных вод, содержащие сотни, а иногда и тысячи различных видов примесей, дают неинформативный и «грязный» сигнал. ИК-анализ, в целом, более глубокий метод, чем спектрофотометрия, дающий более точные результаты, но и требующий большей подготовленности как исследователя, так и образцов.

Расчет результата

Современные приборы автоматически рассчитывают все необходимые для исследователя параметры и дают спектрограммы, готовые к прочтению и интерпретации исследователем. Более старые приборы могут требовать дополнительных вычислений, производимых исследователем. Это вносит определенную возможность человеческой ошибки, поэтому более современное оборудование предпочтительно для работы. Тем не менее, спектрограммы образцов, содержащих более одного анализируемого вещества, требуют правильного чтения, что тоже обуславливает достаточно высокие требования к квалификации оператора оборудования.

Оптимальный итог

Современные спектрофотометры проводят расчёт по результатам анализа в автоматическом режиме и учитывают различные процессы, происходящие в исследуемом веществе. Примером такого взаимодействия, учитываемого прибором, выступает «эффект сита» – способность частиц исследуемого вещества при высокой концентрации экранировать другие частицы в исследуемом растворе и, как следствие, изменять оптические свойства пробы. Для учёта и противодействия таким взаимодействиям частиц современные приборы могут определять превышение концентрации в исследуемой пробе по косвенным признакам и предупреждать исследователя про возможные погрешности измерения.

Общая оптическая плотность исследуемого вещества и его спектрограмма могут строиться по данным, получаемым напрямую с детектора. В таком случае, следует говорить об обычном значении оптической плотности. Также, существует понятие относительной оптической плотности.

Относительный (с выявлением ошибок)

Относительной оптической плотностью называется величина x, равная отношению оптической плотности исследуемого вещества к оптической плотности холостого раствора. Метод, требующий холостых растворов, часто используется в случаях, когда оптические характеристики исследуемого вещества показывают отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера, а также, когда исследователю доступны более старые приборы.

Как и во всех других методах анализа, в спектрофотометрии приветствуется многократное измерение свойств образцов, а затем математическая их обработка.

Так, на территории России и СНГ, большинство учебных лабораторных работ, посвящённых спектрофотометрии, требуют от студентов как минимум троекратного измерения оптической плотности образца, а затем усреднения полученных показателей. Этот подход позволяет учесть ошибки и неточности метода, включающие в себя и различные физические взаимодействия частиц исследуемого вещества, такие, как «эффект сита», и другие.

Преимущества, достоинства и недостатки спектрофотометров

Спектрофотометры – исключительно чувствительные приборы, позволяющие обнаруживать следовые количества различных веществ. Можно применять их во многих отраслях техники, даже в системах безопасности аэропортов. Интересно, что в некоторых аэропортах мира (особенно часто – в Израиле) сотрудники безопасности отбирают пробы с багажа пассажиров и затем подвергают их анализу, в том числе и спектрофотометрическому. Это позволяет обнаруживать как следы контакта со взрывчатыми веществами, так и непосредственно взрывчатку.

Высокая чувствительность приборов накладывает определённые ограничения на их работу, ведь малейшие примеси будут влиять на точность и «чистоту» аналитических данных.

Основными достоинствами таких приборов, все-таки, следует считать высокую чувствительность и селективность анализов, а также способность работать как с жидкими, так и твёрдыми образцами, их сравнительную простоту, надёжность, долговечность и относительную дешевизну.

Главными недостатками спектрофотометрии следует обозначить подверженность влиянию примесей на точность анализа, невозможность анализа веществ, по которым не существует литературных данных (не установлены спектры поглощения), достаточно высокие требования к квалификации оператора в случае нестандартных примесей и загрязнений, поскольку их установление может быть затруднено, а также сравнительно трудоёмкую пробоподготовку при работе с прибором.

Спектрофотометры, как и многие другие приборы для химического анализа, имеют нишевое применение, обусловленное совокупностью их свойств. Без них невозможно представить современные биохимические и фармакологические производства и лаборатории, также, как и металлургические предприятия. Преимущества спектрофотометрии многократно перевешивают её недостатки, что и обуславливает популярность и распространённость этого метода анализа.